Arkeolog dan pemecah teka-teki yang rajin, Profesor Layton, dan asistennya Luke terperangkap dalam sebuah petualangan saat sosok bertopeng mencuri seluruh gedung opera dan memaksa mereka yang hadir untuk memainkan permainan berisiko tinggi. Pemenangnya akan menerima hidup kekal, tetapi itu bisa berarti kematian bagi yang kalah.